Anwendung von Puls

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 7354 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Doxycyclin (DOX), ein häufig in der Medizin und Veterinärmedizin eingesetztes Antibiotikum, wird häufig in natürlichen Gewässern nachgewiesen. Die Exposition von Bakterien gegenüber DOX-Resten übt einen Selektionsdruck aus, der zum häufigen Auftreten genetischer Determinanten der DOX-Resistenz bei Mikroorganismen, einschließlich virulenter menschlicher Krankheitserreger, führt. Angesichts der Verringerung der verfügbaren therapeutischen Möglichkeiten haben wir ein kontinuierliches Reaktions-Entladungssystem entwickelt, das eine pulsmodulierte Radiofrequenz-Atmosphärendruck-Glimmentladung (pm-rf-APGD) erzeugt, die für die DOX-Entfernung aus flüssigen Lösungen vorgesehen ist. Im Optimierungsverfahren wurden ein Design of Experiment und eine Response Surface Methodology implementiert. Die Entfernungseffizienz von DOX betrug 79 ± 4,5 % und die resultierenden Abbauprodukte wurden durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Diodenarray-Detektion, Flüssigkeitschromatographie-Vierfach-Flugzeit-Massenspektrometrie, Ultraleistungsflüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie, gesamter organischer Kohlenstoff, insgesamt identifiziert Stickstoff, Attenuated Total Reflectance Furrier Transform–Infrared und UV/Vis-basierte Methoden. Die mit pm-rf-APGD behandelte DOX-Lösung verlor aufgrund der erzeugten reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies entweder ihre antimikrobiellen Eigenschaften gegenüber Escherichia coli ATCC25922 oder verringerte die bioziden Aktivitäten um 37 % bzw. 29 % im Vergleich zu Staphylococcus haemolyticus ATCC29970 und Staphylococcus aureus ATCC25904. jeweils. Die zukünftige Implementierung dieser effizienten und umweltfreundlichen Antibiotika-Abbautechnologie in Abwasserreinigungssystemen wird vorhergesagt.

Die zunehmende Antibiotikaresistenz virulenter menschlicher Krankheitserreger ist heutzutage eine der alarmierendsten medizinischen Bedrohungen. Dies liegt daran, dass diese Medikamente häufig falsch verschrieben oder in unzureichender Dosierung verabreicht werden. Antibiotika finden in vielen Ländern auch Anwendung für präventive, nichttherapeutische Zwecke oder zur Förderung des Tierwachstums. In den USA beispielsweise werden 50 % der jährlich produzierten 22.700 Tonnen dieser Stoffe in der Tierhaltung, Landwirtschaft und Aquakultur genutzt1. Aufgrund der hohen Produktions- und Anwendungsraten können diese Verbindungen, entweder in einheimischer oder metabolisierter Form, zusammen mit Abwaschungen von den Feldern sowie direkten Einleitungen aus der Tierhaltung/Lebensmittelverarbeitung in Oberflächengewässer, Grundwasser oder Sedimente gelangen und nur teilweise gereinigt werden kommunale, medizinische oder pharmazeutische Abwässer2. Es muss berücksichtigt werden, dass herkömmliche Kläranlagen bei der Zersetzung dieser Arzneimittelgruppe ineffizient sind. Aufgrund der starken bioziden Wirkung dieser Stoffe könnten die durch Antibiotika ausgelösten Veränderungen in der Bakterienpopulation im Abwasseraufbereitungssystem die Wirksamkeit der Abbauprozesse organischer Stoffe beeinträchtigen. Wenn teilweise oder nicht abgebaute Antibiotika trotz Störungen in der Nitrifikationsreaktion3 in die natürliche Umwelt gelangen, sind negative Auswirkungen auf frühe Entwicklungsstadien von Wasserorganismen4, Störungen der Biodiversität mikrobieller Gemeinschaften5 und die Entwicklung von Resistenzen gegen diese Moleküle6 zu erwarten stattfinden. Die Unterwerfung unter den Selektionsdruck subletaler Dosen von Antibiotika führt zur Selektion natürlicher Bakterienpopulationen, die Resistenz-assoziierte genetische Determinanten beherbergen. Diese Gene oder Gencluster werden entweder vertikal oder horizontal übertragen, während letzterer Ansatz Plasmide, mobile genetische Elemente oder Bakteriophagen umfasst7. Der Erwerb dieser genetischen Kassetten kann auch durch die Verschlingung freier DNA erfolgen7. Daher wird Antibiotikaresistenz, die häufig bei Mikroorganismen aus Gewässern oder Böden nachgewiesen wird6, übertragen und akkumuliert sich in resistenten oder multiresistenten menschlichen Krankheitserregern wie Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae, Salmonella sp. Escherichia coli, Acinetobacter baumanii, Enterocccus sp., Clostridium difficile usw.8. Aus diesem Grund gelten Antibiotika, darunter Doxycyclin (α-6-Desoxyoxytetracyclin; DOX), als neu auftretende Schadstoffe, deren effiziente Beseitigung neue Herausforderungen mit sich bringt. Aufgrund des Fehlens entsprechender Wasserqualitätsvorschriften stellt das Vorhandensein dieser Stoffe zweifellos eine ernsthafte Gefahr für die natürliche Umwelt und die menschliche Gesundheit dar9.

In dieser Studie haben wir uns auf DOX konzentriert, ein kostengünstiges, halbsynthetisches Antibiotikum, das zur Klasse der Tetracycline der zweiten Generation gehört. Dieses Breitbandmedikament mit bakteriostatischen Eigenschaften wird seit über 50 Jahren10 verwendet, um das Wachstum grampositiver und gramnegativer Bakterien, einschließlich aerober und anaerober Bakterien, zu hemmen. Genauer gesagt stört DOX die Proteinsynthese an bakteriellen 70 S-Ribosomen, indem es die Bindung von Aminoacyl-tRNA an die Akzeptorstelle des mRNA-Translating-Komplexes verhindert. Aus klinischer Sicht ist die recht gute Verträglichkeit, das breite therapeutisch-toxische Fenster, die schnelle Darmresorption, die gute Flüssigkeits- und Gewebepenetration und die verlängerte Halbwertszeit im Blut zu berücksichtigen11,12. DOX wird in der medizinischen Praxis häufig zur Behandlung vieler Beschwerden und Krankheiten eingesetzt, z. B. Infektionen des Urogenitaltrakts, des Magen-Darm-Trakts oder der Atemwege, Akne, Rosacea, Lyme-Borreliose, Cholera, Sepsis oder zur Vorbeugung von Malaria9,10,11. Obwohl DOX häufig zur Bekämpfung bakterieller Infektionen beim Menschen verschrieben wird, findet es auch Anwendung in der Veterinärmedizin oder als krankheitsvorbeugender oder wachstumsfördernder Zusatz zu Tierfutter13. Leider wird DOX nach oraler Verabreichung nicht in großem Umfang verstoffwechselt, da ca. 40–45 % der eingenommenen Dosis werden nach 72 Stunden und 11 Minuten im Urin ausgeschieden. Studien zur Persistenz dieses Arzneimittels ergaben, dass die Halbwertszeit von DOX beispielsweise in unter Feldbedingungen gealtertem Schweinegülle 25,7 Tage beträgt14. In Bezug auf die aquatische Umwelt zeigten Zaranyika et al.9, dass die in Flusswasserproben eingebrachte DOX-Konzentration während der 90-tägigen Inkubation von 1 µg mL-1 auf über 0,1 µg mL-1 sank. Daher könnte neben der häufigen Anwendung die Beständigkeit dieses Arzneimittels in der natürlichen aquatischen Umwelt der Grund dafür sein, dass in den Flüssen der USA bzw. Chinas bemerkenswerte DOX-Konzentrationen von 17,9 ng L−1 bzw. 0,95 ng L−1 nachgewiesen wurden , insbesondere in unmittelbarer Nähe von großen Stadtgebieten, Futterplätzen oder Fischteichen9. Selbst nach der Exposition gegenüber niedrigen DOX-Konzentrationen werden in Bakterienpopulationen folgende Resistenzmechanismen ausgelöst: Veränderungen am Wirkort des Arzneimittels, eine verminderte Aufnahme oder ein Abpumpen des aktiven Moleküls über Effluxpumpen11,12.

Um umwelt- und gesundheitsbezogene Bedenken im Zusammenhang mit dem Erwerb von Antibiotikaresistenzdeterminanten gegen tierische und menschliche bakterielle Krankheitserreger anzugehen, wurden bis heute verschiedene Ansätze zum Abbau dieser Arzneimittel vorgeschlagen. Mittlerweile wurden hydrothermale Prozesse, Adsorptionsstrategien sowie konventionelle und elektrochemische fortgeschrittene Oxidationsprozesse mit dem Ziel der Zersetzung von Antibiotika untersucht15. Obwohl diese Prozesse gut untersucht sind und in einigen Abwasserreinigungssystemen eingesetzt werden, wird der vollständige Abbau der eingeführten organischen Verbindungen mit diesen Techniken als zeitaufwändig angesehen16. Darüber hinaus wurde über eine erhebliche Toxizität der resultierenden Zwischenprodukte gegenüber Wasserorganismen und gelegentlich nicht zufriedenstellende Zerfallsraten der untersuchten Verbindungen berichtet4,16. Eine sehr vielversprechende und wirksamere Alternative zum Abbau von Antibiotika als die oben aufgeführten Techniken könnte die Verwendung von kaltem Atmosphärendruckplasma (CAPP)17 sein. Die mögliche Anwendung von CAPPs zur wirksamen Zersetzung organischer Verbindungen, einschließlich Arzneimitteln, ist außerdem mit der Produktion verschiedener reaktiver Spezies verbunden, darunter reaktive Sauerstoffspezies (ROS), reaktive Stickstoffspezies (RNS) und solvatisierte Elektronen (e-aq). auf UV-Strahlung und elektromagnetische Felder, die den CAPP-Vorgang begleiten18. Da die erstgenannten reaktiven Individuen definierte Red-Ox-Potenziale aufweisen, könnten die CAPP-basierten Technologien und Prozesse für Abwasseraufbereitungsanlagen nützlich sein.

Bisher wurden mehrere CAPP-basierte Technologien zum Abbau verschiedener Antibiotikaklassen eingesetzt, z. B. Fluorchinolone16,17,19, Tetracycline17,20,21 oder Sulfonamide17. Obwohl bisher verschiedene CAPP-Systeme für den Abbau mehrerer Antibiotika verschiedener Gruppen untersucht wurden17, gibt es unseres Wissens nach nur zwei Studien, die über den CAPP-basierten Abbau von DOX aus wässrigen Lösungen berichten20,21. Der Einfluss von zwei Arten von CAPP-Behandlungen, bei denen entweder eine gepulste Gasphasen-Koronaentladung21 oder eine dielektrische Barrierenentladung über oder unter Wasser20 zum Einsatz kommt, auf die Wirksamkeit des DOX-Abbaus wurde in diesen Artikeln kurz diskutiert. Leider wurde der Einfluss von Betriebsparametern auf die DOX-Zersetzungseffizienz bei der Entsorgung von Flüssigkeiten in diesen Arbeiten nicht untersucht20,21. Darüber hinaus arbeiten alle zuvor entwickelten CAPP-basierten Reaktions-Entladungssysteme, die für den DOX-Abbau vorgesehen sind, im nicht fließenden Modus, was bedeutet, dass das gereinigte Volumen des DOX-haltigen Abwassers durch das Gesamtvolumen des Wasserbehälters begrenzt ist20,21 .

Hier haben wir ein neuartiges CAPP-basiertes Reaktions-Entladungssystem mit kontinuierlichem Fluss entwickelt und optimiert, das eine pulsmodulierte Hochfrequenz-Atmosphärendruck-Glimmentladung (pm-rf-APGD) für einen effektiven Abbau von DOX verwendet. Darüber hinaus haben wir entweder einen Verlust oder eine erhebliche Abnahme der bioziden Eigenschaften des untersuchten Arzneimittels nachgewiesen. Die grundlegende Forschungshypothese ging davon aus, dass die Produktion von ROS, RNS und e-aq, die aus dem PM-RF-APGD-Betrieb in Kontakt mit einem fließenden (medikamentenhaltigen) Abwasser stammt, zu einem hochwirksamen Abbau von DOX unter den ursprünglich definierten und überprüften Bedingungen führen würde optimalen Betrieb dieses CAPP-Systems. Um diese optimalen Betriebsparameter zu finden, wurde die fortgeschrittene statistische Methode, dh Design of Experiments (DoE) gefolgt von Response Surface Methodology (RSM), angewendet. Die Effizienz des DOX-Abbaus wurde mithilfe eines Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Diodenarray-Detektionssystems (HPLC-DAD) bewertet. Die Produkte des DOX-Abbaus, die aus der PM-RF-APGD-Behandlung resultieren, wurden mithilfe von Ultraperformance-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (UPLC-MS/MS) und Flüssigkeitschromatographie-Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometrie (LC-QToF MS) aufgedeckt ). Um den Einfluss des untersuchten pm-rf-APGD-Systems auf die chemische Zusammensetzung des DOX-haltigen Abwassers zu ermitteln, wurden außerdem dessen Gesamtgehalt an organischem Kohlenstoff (TOC) und Gesamtstickstoff (TN) sowie eine qualitative Analyse durch attenuiertes Abwasser bestimmt Totalreflexions-Furrier-Transformations-Infrarotspektroskopie (ATR FT-IR) und UV/Vis-Absorptionsspektrophotometrie. Anschließend wurden Veränderungen in den antimikrobiellen Eigenschaften der mit pm-rf-APGD behandelten DOX-Lösung im Gegensatz zur Kontrolllösung in Bezug auf aus klinischer Sicht wichtige opportunistische Pathogene des Menschen, d. h. E. coli, S. aureus und Staphylococcus haemolyticus, bewertet. Schließlich wurden PM-RF-APGD-Flüssigkeitsreaktionen und -prozesse, die möglicherweise zum Abbau von DOX führen, vorgeschlagen und im Zusammenhang mit Ergebnissen von Messungen ausgewählter ROS und RNS durch kolorimetrische Methoden diskutiert.

Eine 1000 µg mL-1 DOX-Stammlösung wurde durch Auflösen von 57,7 mg Doxycyclinhyclat (A&A Biotechnology, Polen) in 50 ml entionisiertem Wasser hergestellt. Anschließend wurden drei Arbeitslösungen für das Optimierungsverfahren, darunter 10,0, 55,0 und 100 µg mL−1, sowie Arbeitslösungen für das Validierungsverfahren durch ordnungsgemäße Verdünnung der Stammstandardlösung hergestellt. Darüber hinaus wurden 8 Arbeitsstandardlösungen für die Kalibrierung des HPLC-DAD-Systems hergestellt und lagen im Bereich von 0,002 bis 50,0 µg mL−1. Alle oben genannten Lösungen wurden in braunen Fläschchen bei 4 °C gelagert.

Für den DOX-Abbau wurde ein neuartiges, durchströmtes PM-RF-APGD-basiertes Reaktions-Entladungssystem verwendet, das eine stabile Zündung und einen stabilen Betrieb der CAPP-Quelle unter definierten Betriebsbedingungen ermöglicht (Abb. S1, Tabelle S1). Im untersuchten System erfolgte die Einführung DOX-haltiger Lösungen über eine Quarzkapillare (OD = 4,00 mm). Auf dieser Kapillare wurde ein Graphitrohr (Außendurchmesser = 6,00 mm) montiert. Durch Anbringen eines Pt-Drahts am Graphitrohr und Abdecken mit einem strombeständigen Klebeband wurde ein elektrischer Kontakt zur kontinuierlich gepumpten Lösung (Flowing Liquid Electrode, FLE) hergestellt. Die zweite Elektrode war ein geschärfter, stiftförmiger Metallstab (Außendurchmesser = 3,2 mm), koaxial zum Quarzrohr und etwa 3,0 mm vom Rand dieses Rohrs entfernt platziert. pm-rf-APGD wurde im Spalt zwischen der Oberfläche des FLE und der letzteren Metallelektrode erzeugt. Mithilfe einer Dora-PM-RF-Wechselstromversorgung (Dora Electronic Equipment, Polen) wurde an beide Elektroden ein Hochspannungspotential (HV) angelegt. pm-rf-APGD wurde durch Anlegen einer (50 kHz) Spannungswelle initialisiert, moduliert mit Frequenzen zwischen 500 und 1400 Hz, mit einem Arbeitszyklus im Bereich von 30 bis 50 % (Tabelle S1). Nach Einführung der DOX-Lösung in das PM-RF-APGD-basierte Reaktions-Entladungssystem wurden Teile dieser Lösung für weitere Analysen in braune Fläschchen gesammelt.

Um die Betriebsparameter des PM-RF-APGD-basierten Reaktions-Entladungssystems zu ermitteln, die für eine effiziente Zersetzung von in der kontinuierlich zugeführten Lösung gelöstem DOX unter Verwendung der untersuchten CAPP-Quelle geeignet wären, wurde eine auf DoE basierende Multiparameteroptimierung durchgeführt angewandt. Um das Optimierungsexperiment durchzuführen, wurde ein Box-Behnken-Antwortoberflächendesign verwendet (Tabelle S1). Hier wurden 15 randomisierte Behandlungen gemäß der Matrix einbezogen, die die Informationen zu einem Standardlauf, einer Laufreihenfolge der Experimente und Bedingungen in Bezug auf 3 verschiedene Ebenen der untersuchten Betriebsparameter (unkodiert und kodiert (− 1, 0, + 1)) umfasst ) in Klammern). Die oben genannten Betriebsparameter waren wie folgt: die DOX-Konzentration (A, in µg mL−1), die Flussrate der FLE-Lösung (B, in ml min−1) und der Arbeitszyklus für Hochfrequenzimpulse ( C, %) moduliert den Wechselstrom, der die Elektroden des PM-RF-APGD-Systems versorgt. Die verfolgten Antwortvariablen für das durchgeführte Box-Behnken-Reaktionsoberflächendesign waren der pH-Wert der DOX-haltigen Lösung, gemessen nach der pm-rf-APGD-Behandlung, und die Temperatur (T, °C). Im Fall des PM-RF-APGD-Systems stand der Arbeitszyklus in direktem Zusammenhang mit der Entladeleistung bei einer bestimmten Spannung und Frequenz des RF-Änderungsstroms. Die letztgenannten Parameter wurden nicht geändert; Daher hing die an das PM-RF-APGD-System weitergeleitete Leistung nur vom Arbeitszyklus ab. Hier wurden die höchste Einschaltdauer und die höchste Entladeleistung angewendet. Für den angewandten Arbeitszyklus wie 30, 40 und 50 % wurde eine Gesamtentladeleistung von 51, 68 bzw. 84 Watt ermittelt. Um die Präzision der Antwortvariablen des angewandten Box-Behnken-Antwortflächendesigns zu beurteilen, wurden 3 Mittelpunkte in die Matrix einbezogen (Tabelle 1). Betrachtet man die Werte der verfolgten Reaktionen an diesen Mittelpunkten, war die Präzision hoch, nämlich 3,2 % für pH (mit einem Mittelwert von 3,05) und 5,1 % für T (mit einem Mittelwert von 34,3 °C). Alle Behandlungen für das Box-Behnken-Reaktionsflächendesign wurden in einem Versuchsblock durchgeführt. Dementsprechend wurden DOX-haltige Lösungen (in 3 verschiedenen Konzentrationen; Tabelle S1) kontinuierlich in das pm-rf-APGD-Reaktions-Entladungssystem (mit 3 verschiedenen Flussraten; Tabelle S1) gepumpt, das unter der gepulsten modulierten Hochfrequenz betrieben wurde (pm-rf) Wechselstrom mit einem Arbeitszyklus auf 3 verschiedenen Ebenen (Tabelle S1). Aufgrund des Kontakts der Lösungsoberfläche mit der Entladungsphase und der in der Grenzflächenzone stattfindenden Plasma-Flüssigkeits-Wechselwirkungen wurden kurz- und langfristige reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies (RONS) erzeugt, die zur Zersetzung von DOX in den eingeführten Lösungen führten. Die Teile der überlaufenden Lösungen wurden nach der PM-RF-APGD-Behandlung gesammelt und ihre T und pH wurden sofort gemessen. Hierzu wurden ein Thermometer von Hanna Instruments (Polen) und ein pH-Meter Elmetron CPC-505 (Polen) eingesetzt.

Die gesammelten Daten (Werte der Antwortvariablen) für das angewandte Antwortoberflächendesign wurden unter Verwendung vollständiger quadratischer Funktionen analysiert, einschließlich der Wirkung linearer (A, B, C) und quadratischer (A2, B2, C2) Terme sowie zweier -Weg-Interaktionsterme (A × B, A × C, B × C). Die Gleichungen dieser Funktionen, die zur Modellierung der Messdaten für jede der getesteten Reaktionen, d. h. T und pH, verwendet wurden, lauteten wie folgt: d0 + a1A + b1B + c1C + a2A2 + b2B2 + c2C2 + a3A × B + b3A × C + c3B × C, wobei d0, a1–a3, b1–b3 und c1–c3 den Regressionskoeffizienten entsprachen. Um statistisch signifikante Terme in den Antwortoberflächen-Regressionsmodellen für T und pH zu finden, wurde der Algorithmus zur Rückwärtseliminierung von Termen auf dem Signifikanzniveau von 90 % (α zum Entfernen gleich 0,1) verwendet, was ein hierarchisches Modell bei jedem Schritt des Algorithmus erforderte für alle Begriffe. Um die Anpassung der Antwortoberflächen-Regressionsmodelle zu beurteilen, wurde der Varianzanalysetest (ANOVA) verwendet, der es ermöglichte zu bestimmen, ob die vorgeschlagene Beziehung zwischen den Antwortvariablen und dem Satz von Begriffen statistisch zuverlässig ist und sich als nützlich zur Erklärung der Antwort erweisen wird bei den gegebenen Betriebsbedingungen. Dementsprechend wurde die Anpassungsgüte der Reaktionsoberflächen-Regressionsmodelle durch das Bestimmtheitsmaß (R2) und das angepasste R2 angegeben. Die für die Antwortoberflächen-Regressionsmodelle mit den enthaltenen Termen ermittelten p-Werte sind in Tabelle 1 (für T) und Tabelle 2 (für pH) aufgeführt, um die statistische Signifikanz dieser Modelle darzustellen. Residuen zwischen den gemessenen Daten und den durch die entwickelten Reaktionsoberflächen-Regressionsmodelle angepassten Daten wurden ebenfalls visuell überprüft, basierend auf den entsprechenden Normalwahrscheinlichkeitsdiagrammen (eine Möglichkeit, zu überprüfen, ob die Residuen normalverteilt sind oder nicht) und Streudiagrammen der standardisierten Residuen gegenüber dem Laufreihenfolge (eine Möglichkeit zu überprüfen, ob die Residuen unabhängig sind). Die Box-Behnken-Reaktionsflächendesignexperimente wurden auch unter Berücksichtigung der Abbaueffizienz der Zielverbindung, bestimmt durch die HPLC-DAD-Methode, als Reaktion des Systems unter verschiedenen Bedingungen der Parameter A, B und C durchgeführt. In diesem Fall wurde ein ähnlicher Ansatz wie zuvor verwendet, dh der Rückwärtseliminierungsalgorithmus wurde bei α = 0,1 angewendet. Das bewertete Modell wurde ebenfalls als gültig erwiesen, d. h. der p-Wert für das Modell betrug 0,004 (<< α) und der p-Wert für den Test auf mangelnde Anpassung betrug 0,198 (> α). Die Anpassungsgüte wurde durch den recht hohen R2- und angepassten R2-Wert (96,3 bzw. 89,7 %) angezeigt. Die Gleichung der Reaktionsfläche lautete wie folgt: Abbaueffizienz, % = 124,0 + 0,136 A − 1,44 B − 1,398 C − 0,000231 A2 + 0,146 B2 + 0,01823 C2 − 0,0456 AB − 0,00278 AC + 0,0133 BC.

Um am Ende die günstigsten Arbeitsbedingungen des durchströmten PM-RF-APGD-basierten Reaktions-Entladungssystems für die Zersetzung von in wässrigen Lösungen gelöstem DOX zu finden, wurden optimale Betriebsparametereinstellungen unter Berücksichtigung individueller Erwünschtheitsfunktionen für T und pH ausgewählt , also dT und dpH, und der Wert der zusammengesetzten Erwünschtheitsfunktion, also D = (dT × dpH)1/2. Es wurde spezifiziert, dass die günstigsten Bedingungen für den Abbau des oben genannten Antibiotikums erreicht würden, wenn T der Lösung nach ihrer pm-rf-APGD-Behandlung den höchsten Wert (dT = 1) erreichen würde, während ihr pH-Wert am niedrigsten wäre ( dpH = 1). Unter diesen Betriebsbedingungen ist zu erwarten, dass die Konzentration verschiedener RNS und ROS, einschließlich Langzeit-H2O2, O3, NO3−, sowie Kurzzeitkonzentrationen wie ·OH, NO2−, O2− und O21 (Singulett-Sauerstoff). ), wäre am höchsten und sollte am DOX-Abbauprozess beteiligt sein. Die hohe T der Lösung würde die konstante Geschwindigkeit der Zerfalls-/Abbaureaktionen dieses Antibiotikums erhöhen. Aus diesem Grund, dh um RNS und ROS zu identifizieren, die in der Gasphase des betriebenen PM-RF-APGD-Systems erzeugt werden, wurde optische Emissionsspektrometrie (OES) eingesetzt. Die OES-Messungen wurden wie folgt durchgeführt: Die emittierte Strahlung von pm-rf-APGD wurde mittels einer UV-achromatischen Linse (f = 60) auf den Eintrittsspalt (10 µm) eines Shamrock SR-500i-Spektrographen (Andor, UK) abgebildet ). Der Spektrograph war mit holographischen Gittern mit 1200 (Bereich 300–900 nm) und 1800 (Bereich 200–400 nm) Rillen mm-1 und einer UV/Vis-CCD-Kamera Newton DU-920P-OE (Andor, UK) ausgestattet. Es wurde jeweils ein Full Vertical Biding (FVB)-Modus der CCD-Kamera und eine Integrationszeit von 0,1 s angewendet. Für die Datendarstellung und -verarbeitung wurde die Solid S-Software (Andor UK) verwendet.

Abschließend wurde das Validierungsverfahren durchgeführt, um die Genauigkeit der etablierten statistischen Modelle zu überprüfen. In diesem Fall wurde das auf PM-RF-APGD basierende Reaktions-Entladungssystem unter den folgenden Betriebsbedingungen betrieben, die auf der Grundlage beider Modelle (T und pH) ausgewählt wurden, d. h. die FLE-Lösungsdurchflussrate: 2,8 ml min−1 Arbeitszyklus für den pulsmodulierten Hochfrequenz-Wechselstrom von 50 % und die DOX-Konzentration in der Lösung, die an das PM-RF-APGD-basierte Reaktions-Entladungssystem geliefert wird: 51,5 µg mL-1. Unter Berücksichtigung der maximalen Abbaueffizienz waren die optimalen Parametereinstellungen des gefundenen und auf diesem Modell basierenden PM-RF-APGD-Systems wie folgt: A = 10 µg mL−1, B = 2,0 mL min−1 und C = 50 % . Diese Parametereinstellungen führten zu einer Abbaueffizienz von 97,8 ± 8,1 %. Die besondere Bedeutung muss der DOX-Konzentration beigemessen werden, da die Einstellung dieses Parameters zu den experimentell beobachtbaren Hemmzonen für das Bakterienwachstum in der nicht plasmabehandelten Doxycyclin-haltigen Lösung führen muss. Im Gegensatz zum im Plasma abgebauten Antibiotikum muss die Konzentration der biologisch aktiven Verbindung hoch genug sein, also mindestens 50 mg L−1 betragen, um das Wachstum der pathogenen Mikroorganismen zu begrenzen. Die vom Modell erzielte DOX-Konzentration von 10 µg mL-1 konnte im experimentellen Teil dieser Studie nicht genutzt werden, da sie nicht ausreichte, um das Wachstum der untersuchten Mikroorganismen zu hemmen. Im Fall der beiden letztgenannten Parameter, nämlich B und C, die in direktem Zusammenhang mit dem Betrieb des angewendeten Durchfluss-CAPP-Systems stehen, entsprachen ihre optimalen Einstellungen den optimalen Werten, die auf der Grundlage der anhand von T (Temperatur) und pH bewerteten Modelle gefunden wurden der mit PM-RF-APGD behandelten Lösungen. Das neu bewertete Modell bestätigte insbesondere, dass die Entladeleistung am höchsten sein sollte, wie sie bei Verwendung des Arbeitszyklus von 50 % erreicht wird. Darüber hinaus ergab sich bei Anwendung der mit den Modellen für T und pH ermittelten optimalen Einstellungen, also A = 51,5 µg mL−1, B = 2,8 mL min−1 und C = 50 %, das für die Abbaueffizienz etablierte Modell in der Reaktion von 91,3 ± 4,3 %, was nahe an dem Wert lag, der beim Validierungsexperiment der ersten beiden Modelle ermittelt wurde, d. h. 79 ± 4,5 %. In diesem Fall konnten die geplanten mikrobiologischen Untersuchungen durchgeführt werden. Alle diese Zahlen zeigen, dass die optimalen Einstellungen, die auf der Grundlage des Modells gefunden wurden, das für die Abbaueffizienz bewertet wurde, und insbesondere diejenigen, die sich auf den Betrieb des Durchfluss-PM-RF-APGD-Systems beziehen, genauso gut sind wie die optimalen Einstellungen, die unter Verwendung der Modelle ermittelt wurden T und pH. Auf diese Weise waren die Annahmen über die Produktion von RONS und die Abbaueffizienz bei der höchsten T und dem niedrigsten pH-Wert der mit pm-rf-APGD behandelten Lösung einigermaßen gültig. Nachdem die DOX-haltigen Lösungen dem System ausgesetzt wurden, wurde die CAPP-behandelte Lösung gesammelt und ihre T- und pH-Werte gemessen, um sie mit den von beiden Modellen ermittelten Werten zu vergleichen.

Um den Einfluss der pm-rf-APGD-Behandlung auf die Entfernungseffizienz von DOX aus wässrigen Lösungen herauszufinden, wurde die HPLC-DAD-Analyse durchgeführt. Die vorbereiteten Standard-Arbeitslösungen (siehe Kapitel Vorbereitung der Arbeitslösungen) waren bei 4 °C mindestens 1 Monat stabil. Für HPLC-DAD-Messungen wurde ein Nexera XR-System (Shimadzu) verwendet, das aus einem Autosampler SIL-20AC, einer Pumpe LC-20AD, einem Säulenofen CTO-20AC und einem Detektor SPD-M20A bestand. Die verwendete Säule war eine Gemini Gemini-NX (C18, 5 µm, 110A, 150 × 4,6 mm). Der Säulenofen wurde auf 27 °C eingestellt. Die Ofentemperatur des Autosamplers betrug 10 °C. Das Injektionsvolumen betrug 25 µL. Die mobile Phase war zweikomponentig und enthielt die Komponente A (0,1 % Ameisensäure, pH 2,6) und die Komponente B (Acetonitril, ACN). Die Gradientenelution wurde verwendet und sah wie folgt aus: 0 Min. – 15 % B, 10 Min. – 50 % B, 12 Min. – 50 % B, 15 Min. – 15 % B. Die Flussrate der mobilen Phase betrug 1 ml/Min . Die Gesamtzeit jedes chromatographischen Laufs betrug 15 Minuten. Die Retentionszeit von DOX betrug 5,6 Minuten. Der Detektor war auf die Messung der Wellenlängen von 190 bis 800 nm eingestellt, während die Quantifizierung von DOX bei 348 nm durchgeführt wurde. Es wurde bestätigt, dass die Linearität der Detektorreaktion zwischen 0,002 und 50,0 µg mL−1 liegt. Die Quantifizierungsgrenze (LOQ) wurde auf 0,004 µg mL−1 geschätzt, während die Nachweisgrenze (LOD) LOQ/3 betrug. Der Regressionskoeffizient der Kalibrierungskurve betrug 0,9998. Die durch die relative Standardabweichung (RSD) bestimmte Präzision lag im Bereich von 1,08–5,80 % (mindestens 3 Wiederholungen der Injektion für jede der 8 Konzentrationsstufen).

Um die DOX-Abbauprodukte aufzudecken, wurden die UPLC-MS/MS-Analysen mit einem UPLC-MS/MS-Gerät (Agilent Technologies) durchgeführt, das aus einem Flüssigkeitschromatographen 1290 Infinity und einem Massenspektrometer 6550 iFunnel Q-TOF bestand. Es wurde die Säule ZORBAX Eclipse Plus C18 (Rapid Resolution HD 2,1 × 50 mm, 1,8 µm, Agilent) verwendet. Die mobile Phase war zweikomponentig und enthielt die Komponente A (0,1 % Ameisensäure in Wasser mit 3 % ACN) und die Komponente B (0,1 % Ameisensäure in ACN). Die Flussrate der mobilen Phase betrug 400 µL min−1. Das Gradientenprogramm für die Elution wurde wie folgt eingestellt: von 2 % B auf 100 % B in 7 Minuten. Bei der Aufnahme der vollständigen Massenspektren wurde der Massenbereich von 100–1000 im negativen und positiven Ionenmodus überwacht. Das Instrument wurde vor der Analyse abgestimmt und die folgenden optimierten Bedingungen wurden eingestellt: die Kapillarspannung von 3,5 kV, die Gastemperatur von 250 °C, die Hüllgastemperatur von 300 °C, die Hüllgasdurchflussrate von 11 L min−1 , die Kollisionsgasströmungsrate von 0,2 mL min−1, die Fragmentorspannung von 175 V und die Düsenspannung von 2 kV. Das Injektionsvolumen betrug 1 µL. Die analysierten Proben wurden aufgetaut, mit dem Vortex gemischt und filtriert (PET-Filter mit 0,2 µm Porengröße) und ihre 1-ml-Portionen wurden vor den Messungen in chromatographische Fläschchen aus braunem Glas überführt.

Um die Wirkung von pm-rf-APGD auf DOX unter optimalen Betriebsparametern des verwendeten Durchfluss-CAPP-Systems zu beurteilen, wurden TOC-, TN-, ATR-FT-IR- und UV/Vis-Analysen der DOX-haltigen Lösung, die dem CAPP unterzogen wurde, durchgeführt Behandlung durchgeführt wurden. Darüber hinaus wurde zum Vergleich die unbehandelte DOX-haltige Lösung analysiert. Die Konzentrationen von TOC und TN wurden mit einem Multi N/C 3100 Analytik Jena (Jena, Deutschland) bestimmt. Zur Bestimmung des TOC in den analysierten Proben wurde die Methode des nicht ausspülbaren organischen Kohlenstoffs (NPOC) angewendet. Der TN-Gehalt in den analysierten Proben wurde anhand von Nitrat-Stickstoff (NO3–N), Nitrit-Stickstoff (NO2–N), Ammoniak-Stickstoff (NH3–N) und organisch gebundenem Stickstoff bewertet. Die TOC/TN-Messungen wurden in braunen Fläschchen durchgeführt, um DOX vor einem eventuellen unkontrollierten Abbau unter dem Vis-Licht zu schützen. Die TOC/TN-Analysen wurden durchgeführt, indem 10 ml der analysierten Proben in braune Fläschchen gegossen und mit 500 µL 2 mol L−1 HCl (Avantor Performed Materials, Polen) angesäuert wurden, um einen pH-Wert von 2 zu erreichen (HCl wurde hinzugefügt, um CO2 zu entfernen). . Zusätzlich wurde als Kontrolle der Gehalt an TOC/TN in entionisiertem Wasser gemessen. Die gesammelten Daten wurden mit Hilfe von GraphPad Prism 8.0 statistisch getestet, indem der ungepaarte t-Test (Tukeys Post-hoc-Test, parametrische Analyse) verwendet und zweiseitige p-Werte ermittelt wurden.

Die ATR-FT-IR-Messungen wurden mit einem Jasco FT-IR 4700 (MD, USA)-Gerät durchgeführt, das mit einem Diamant-ATR-Aufsatz ausgestattet war. Die ATR-FT-IR-Spektren wurden im Bereich von 4000–400 cm−1 mit einer Auflösung von 4 cm−1 aufgezeichnet, indem pro Analyse 64 Scans durchgeführt wurden. Die gesammelten Daten wurden dann mit der Spectra Analysis-Software analysiert. Im Gegenzug wurden UV/Vis-Absorptionsspektren mit einem Jasco V-530 (MD, USA)-Instrument im Bereich von 200–1100 nm mit einer Auflösung von 1 nm aufgezeichnet. In ähnlicher Weise wurden die gesammelten Daten anschließend mithilfe der Spectra Analysis-Software untersucht.

Um den Einfluss der PM-RF-APGD-Behandlung (unter optimalen Betriebsparametern des angewandten Durchflusssystems) auf die antibakteriellen Eigenschaften der DOX-haltigen Lösung zu ermitteln, wurde ein Standard-Scheibendiffusionstest unter Einbeziehung der unbehandelten und PM-RF durchgeführt -APGD-behandelte DOX-Lösungen wurden an Bakterienstämmen durchgeführt, die als humane opportunistische Krankheitserreger eingestuft sind (Tabelle 3). Bei den ausgewählten Stämmen handelt es sich entweder um Modellmikroorganismen, die häufig in Antibiotika-Empfindlichkeitstests verwendet werden, oder um klinische Isolate mit pathogenen Eigenschaften (Tabelle 3). Diese Stämme stammen aus der Sammlung der Intercollegiate Faculty of Biotechnology University of Danzig und der Medical University of Danzig (IFB UG & MUG), in der sie bei – 80 °C in 40 % (v/v) Glycerin gelagert wurden. Vor den Experimenten wurden Bakterienzellen (Tabelle 3) aus einem entsprechenden Bestand gesammelt und reduktiv auf einem Mueller-Hinton-Agar-Medium (M-HA; BTL, Polen) ausgebreitet. Die beimpfte Platte wurde 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Dann wurde eine Schleife der Bakterienzellen von der M-HA-Platte gesammelt und zur Beimpfung von 5 ml der Mueller-Hinton-Brühe (M-HB; BTL, Polen) verwendet. Es folgte eine 24-stündige Inkubation der Kultur unter Schütteln bei 120 U/min. Anschließend wurde die Übernachtkultur zentrifugiert (10 min; 6500 U/min). Der Überstand wurde verworfen und die ausgefällten Bakterienzellen wurden zweimal in sterilem Wasser gewaschen. Die optische Dichte der Bakteriensuspension wurde unter Verwendung eines DEN-1B-Densitometers (BioSan, Lettland) auf 0,5 im McFarland-Maßstab (McF) (ca. 1,5 × 108 Zellen pro ml) eingestellt.

Die vorbereiteten 0,5-McF-Suspensionen von Bakterienzellen (Tabelle 3) wurden zur Durchführung des oben erwähnten Scheibendiffusionstests verwendet. In diesem Fall wurde ein steriles Wattestäbchen in der vorbereiteten 0,5-McF-Bakteriensuspension suspendiert (Tabelle 3). Die überschüssige Flüssigkeit wurde verworfen, bevor die gesammelte Bakteriensuspension (Tabelle 3) dreimal über die Oberfläche der M-HA-Platte (20 cm3) verteilt wurde. Anschließend wurden leere Scheiben (Biomaxima, Polen) mit einem Durchmesser von 5 mm auf die Oberfläche des beimpften M-HA-Mediums gelegt (3 Scheiben pro Platte). 10 µl entweder der mit pm-rf-APGD behandelten DOX-Lösung oder der unbehandelten DOX-haltigen Kontrolllösung wurden auf eine leere Scheibe gegossen. Anschließend wurden die M-HA-Platten 1 Stunde lang bei 4 °C inkubiert, um die Diffusion des Wirkstoffs in das Medium zu ermöglichen. Anschließend wurden die Platten vor der Messung der beobachteten Wachstumshemmzonen 24 Stunden lang einer Temperatur von 37 °C ausgesetzt. Dieses Experiment wurde dreifach mit jeweils drei technischen Wiederholungen durchgeführt. Die Ergebnisse wurden visualisiert und hinsichtlich ihrer statistischen Signifikanz unter Verwendung von R 3.1.3 25 getestet. Die beobachteten Durchmesser der bakteriellen Wachstumshemmungszonen, die sich aus der Einwirkung der mit pm-rf-APGD behandelten DOX-haltigen Lösung auf die Mikroben ergeben wurden mit einem zweiseitigen t-Test (entweder Student- oder Welch-t-Test, je nach Erfüllung der Anforderungen für die parametrische Analyse, analysiert mit Shapiro-Wilk- und Levene-Tests) mit denen verglichen, die für Bakterien ermittelt wurden, die unbehandelten Bakterien ausgesetzt waren DOX-haltige Lösung. Für die Durchführung all dieser Berechnungen wurde p < 0,05 implementiert.

Um die Wechselwirkungen und Prozesse an der Schnittstelle des pm-rf-APGD-Systems mit der DOX-Lösung zu bewerten, wurden mehrere kolorimetrische Methoden eingesetzt. Die Konzentrationen der gesamten ROS zusätzlich zu den einzelnen ROS und RNS, wie z. B. H2O2, NO2−, NO3−, wurden in der mit pm-rf-APGD behandelten und unbehandelten DOX-Lösung unter den für diesen Durchfluss festgelegten optimalen Betriebsparametern bewertet Reaktions-Entladungssystem. Die Beschreibung aller verwendeten Methoden finden Sie im Abschnitt „Ergänzende Informationen“. Die Bestimmung des RNS- und ROS-Gehalts erfolgte 10 Minuten nach der PM-RF-APGD-Behandlung der DOX-haltigen Lösung, um diese auf Raumtemperatur abzukühlen.

Um den Abbauweg von DOX während der pm-rf-APGD-Behandlung besser beurteilen zu können, wurden die Aktivitäten signifikanter ROS geschätzt. Bei den Abbauprozessen von DOX sind die wichtigsten reaktiven Bestandteile ·OH, H2O2 und O3. Zur Bestätigung ihrer Beteiligung am DOX-Abbauprozess wurden HPLC-DAD-Analysen für mit PM-rf-APGD behandelte und unbehandelte DOX-Lösungen unter Zusatz geeigneter Scavenger durchgeführt. Die Protokolle für Scavenging-Tests wurden in den Zusatzinformationen ausführlich beschrieben.

Was die Zersetzung von Antibiotika wie DOX aus wässrigen Lösungen betrifft, wurde der Möglichkeit, die CAPPs erzeugenden Systeme in direktem Kontakt mit den Flüssigkeiten, die das gelöste Antibiotikum enthalten, zu verwenden, bisher wenig Aufmerksamkeit geschenkt16,20,26,27,28. In allen oben zitierten Arbeiten wurden CAPPs in Systemen mit nicht kontinuierlichem Fluss aufrechterhalten, daher war die Behandlung der arzneimittelhaltigen Lösungen nicht-fließend und berücksichtigte eher begrenzte Volumina dieser Lösungen, d. h. bis zu maximal 50 ml. Darüber hinaus war die Behandlungszeit in den oben genannten CAPP-Systemen ziemlich lang, da sie typischerweise zwischen 2 und 80 Minuten lag.

In der vorliegenden Arbeit wird eine kombinierte Wirkung verschiedener durch pm-rf-APGD bereitgestellter Wirkstoffe untersucht, darunter kurz- und langfristige RONS, die UV-Strahlung und andere reaktive Spezies, einschließlich NOx, NH, N2 und N2+, die im Gas erzeugt werden Phase der Entladung (weitere Einzelheiten finden Sie in den OES-Spektren in Abb. S2, Ergänzende Informationen), wurde erwartet. Alle diese Wirkstoffe könnten für den effizienten Abbau von DOX, dem Antibiotikum der Tetracyclin-Klasse, verantwortlich sein. Die Konstruktion des vorgeschlagenen Durchflusssystems ermöglichte einen kurzen Kontakt der Lösung mit den plasmaassoziierten Komponenten und verringerte somit die Möglichkeit, den Abbau dieser organischen Verbindung auf eine zu hohe Temperatur zurückzuführen. Auf diese Weise hing die erforderliche Wirkung in erster Linie mit den Plasma-Flüssigkeits-Wechselwirkungen zusammen, während der Abbauprozess des untersuchten Antibiotikums wahrscheinlich über seine Wechselwirkungen mit den von CAPP abgeleiteten reaktiven Spezies erreicht wurde. In Anbetracht des untersuchten Durchfluss-Reaktions-Entladungssystems mit pm-rf-APGD wurde erwartet, dass der effektivste Zerfall von DOX bei der höchsten Lösungstemperatur erreicht werden würde (jedoch nicht > 42 °C, wie experimentell anhand der Arbeitszyklen bestätigt wurde). von 60 % und höher) und den niedrigsten pH-Wert der CAPP-behandelten Lösung, was auf die Bildung von kurz- und langfristigen RONS wie HNO2 bzw. HNO3 hinweist29. Aus diesem Grund waren T- und pH-Werte der DOX-haltigen Lösungen, die mit pm-rf-APGD unter verschiedenen experimentellen Bedingungen behandelt wurden, die Reaktionen des Systems im Box-Behnken-Reaktionsoberflächendesign. Nach Durchführung dieses Versuchsplans gemäß der in Tabelle S1 gezeigten Box-Behnken-Matrix wurde eine T der mit pm-rf-APGD behandelten DOX-Lösung im Bereich von 28,6 bis 36,6 °C ermittelt, während sich ihr pH-Wert von 2,94 auf 3,28 änderte.

Die etablierten Regressionsmodelle für diese beiden Antworten waren statistisch signifikant. Wie in den Tabellen 1 und 2 zu sehen ist, waren die jeweiligen p-Werte für beide Modelle gleich 0,009 (T) und 0,028 (pH) und niedriger als α = 0,1, die im Algorithmus zur Rückwärtseliminierung von Termen verwendet wurden, um die endgültigen Gleichungen zu finden dieser Regressionsmodelle. Die entsprechenden R2-Werte betrugen 66,9 % bzw. 63,1 %. Bemerkenswert ist auch, dass die p-Werte für den Test auf mangelnde Anpassung viel höher waren als der α-Wert, nämlich 0,211 (T) und 0,430 (pH). Dies zeigte deutlich, dass die aufgestellten Gleichungen die Beziehung (in den Tabellen 1 und 2 angegeben) zwischen den Antwortvariablen und den untersuchten Betriebsparametern angemessen beschreiben. Da es keine Hinweise darauf gab, dass die entwickelten Regressionsmodelle nicht zu den erfassten Daten passten, gab es keinen Grund, diese Modelle abzulehnen.

Darüber hinaus wurden die für beide Regressionsmodelle erhaltenen Residuen visuell analysiert (siehe Abb. 1). Im Fall der normalen Wahrscheinlichkeitsdiagramme folgten alle Datenpunkte den geraden Linien, was bestätigte, dass sie sowohl im Fall von T als auch im Fall des pH-Werts normalverteilt waren. Beim Übergang zu den Streudiagrammen der standardisierten Residuen gegenüber der Laufreihenfolge wurden die Datenpunkte eher zufällig auf beiden Seiten der Mittellinien platziert, was beweist, dass die Residuen nicht untereinander korrelierten. All dies zeigte, dass beide Regressionsmodelle angewendet werden könnten, um solche Betriebsparameter des Durchfluss-Reaktions-Entladungssystems richtig auszuwählen, die eine effiziente DOX-Zersetzung begünstigen würden.

Die Residuendiagramme für Temperatur (T) und pH zeigen die Verteilung der analysierten Residuen.

Betrachtet man die Auswirkung der Betriebsparameter auf T (°C) der DOX-Lösung, die mit dem Durchfluss-PM-RF-APGD-System behandelt wird, scheint es, dass diese linear zunimmt, während der Arbeitszyklus (der Betriebsparameter C) des PM-Rf-APGD-Systems steigt. Der HF-Änderungsstrom, der die Entladung versorgt, ist ebenfalls erhöht (Abb. 2). Dies könnte in direktem Zusammenhang mit der Dauer der Impulse und der verstärkten Übertragung der elektrischen Feldenergie auf das Plasma stehen und folglich zu einer Intensivierung der Prozesse im Zusammenhang mit dem Plasmabetrieb und der Bildung von ROS und RNS in der Gasphase der Entladung führen und in den behandelten Lösungen. In Bezug auf die Auswirkung der FLE-Lösungsdurchflussrate (Betriebsparameter B) wurde festgestellt, dass die Temperatur (°C) einer solchen Lösung bis zu einem bestimmten Wert anstieg und dann abnahm, wahrscheinlich aufgrund des Kühleffekts und a relativ kurze Kontaktzeit der PM-RF-APGD-Plasmakomponenten mit den Lösungsbestandteilen.

Die Auswirkung der Betriebsparameter von pm-rf-APGD auf die Temperatur (T, °C) und den pH-Wert der mit pm-rf-APGD behandelten Lösung (gemäß der in Tabelle S1 dargestellten Box-Behnken-Matrix).

Unter Berücksichtigung des pH-Werts der mit pm-rf-APGD behandelten DOX-Lösung wurden die günstigsten Bedingungen, d die niedrigste Flussrate der FLE-Lösung. Im letzteren Fall wäre die Kontaktzeit mit den kurz- und langfristigen RONS in der Gasphase der Entladung sowie die Rate der Plasma-Flüssigkeits-Wechselwirkungen am intensivsten. Dies hätte sicherlich Auswirkungen auf die effektive Produktion von RONS in der Lösung und würde zu einer effizienten Zersetzung von DOX führen. Es wurde auch festgestellt, dass der Einfluss der DOX-Konzentration (der Betriebsparameter A) wichtig ist, um eine hohe Abbaueffizienz von DOX nach der pm-rf-APGD-Behandlung zu erreichen. Darüber hinaus wurde darauf hingewiesen, dass die verarbeiteten Lösungen und/oder Flüssigkeiten, die DOX enthalten, möglicherweise vor der PM-rf-APGD-Behandlung zunächst verdünnt werden müssen.

Unter Berücksichtigung beider Reaktionsoberflächen-Regressionsmodelle und der Annahme, dass unter den Bedingungen der höchsten T und des niedrigsten pH-Werts (aufgrund der Zersetzungsprozesse des Antibiotikums durch RONS, die über die Plasma-Flüssigkeits-Wechselwirkungen erzeugt werden) eine effiziente Antibiotika-Zersetzungsrate erreicht wird, war dies der Fall fanden heraus, dass solche Bedingungen geschaffen werden könnten, wenn die Lösung, die DOX in einer Konzentration von 51,5 µg L−1 enthält, mit einer Durchflussrate von 2,8 ml min−1 in das PM-rf-APGD-Reaktions-Entladungssystem eingeleitet würde, das unter Verwendung der Einschaltdauer aufrechterhalten würde Zyklus von 50 %. Unter diesen Bedingungen wurden folgende modellierte Antwortvariablen festgelegt: 36,6 ± 0,8 °C (T) und 3,01 ± 0,04 (pH). Somit betrugen die Werte von dT und dpH 1,000 bzw. 0,803. Der Wert der D-Funktion betrug 0,896, was eine einigermaßen gute Auswahl der optimalen Bedingungen der durchgeführten Multiparameteroptimierung zeigt.

Für die oben genannten Einstellungen der Betriebsparameter (A: 51,5 µg mL-1, B: 2,8 mL min-1, C: 50 %) wurden beide Response-Surface-Regressionsmodelle validiert. Es wurden unabhängige Experimente durchgeführt und das Reaktions-Entladungssystem unter den festgelegten Betriebsparametern betrieben, um eine DOX-Lösung zu behandeln. Dann wurden T und pH der mit pm-rf-APGD behandelten Lösung gemessen. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten: T = 37,4 ± 0,1 °C und pH = 2,90 ± 0,10, und sie stimmten gut mit den von den entwickelten Modellen vorhergesagten Werten überein.

Die DOX-Konzentration in den unbehandelten und mit pm-rf-APGD behandelten Lösungen, die für die Modellvalidierung vorbereitet wurden, wurde mittels HPLC-DAD bestimmt. Es wurde festgestellt, dass in der vorbereiteten unbehandelten DOX-Lösung die quantifizierte DOX-Konzentration 54,5 µg mL-1 betrug (anstelle von 51,5 µg mL-1). Andererseits betrug die DOX-Konzentration in der mit pm-rf-APGD behandelten Lösung 11,38 µg mL−1. Basierend auf den in Abb. S3 (Ergänzende Informationen) dargestellten Chromatogrammen wurde berechnet, dass 79 ± 4,5 % des DOX effektiv aus der anfänglichen DOX-Lösung entfernt wurden, indem die pm-rf-APGD-Behandlung unter den optimalen Betriebsparametern durchgeführt wurde, die für den angewendeten Durchfluss festgelegt wurden -durch Reaktions-Entladungssystem.

Im nächsten Schritt war es entscheidend, die Abbauprodukte der Antibiotika zu identifizieren, da diese Stoffe Auswirkungen auf die natürliche Umwelt haben könnten. Aus diesem Grund wurde hochauflösendes UPLC-MS/MS verwendet, um die DOX-Abbauprodukte zu identifizieren, nachdem die wässrige Lösung dieses Arzneimittels mit pm-rf-APGD behandelt wurde, das unter den optimalen Betriebsparametern durchgeführt wurde. Die Gesamtionenstromchromatogramme (TIC, ESI+) der DOX-Lösungen vor und nach der CAPP-Behandlung sind in Abb. 3 dargestellt. Auf dem Chromatogramm der unbehandelten DOX-Lösung wurden zwei Peaks mit m/z von 445,16 [M + H ]+. Der Peak bei 2,6 Minuten stammte von DOX, während der Peak bei 2,1 Minuten höchstwahrscheinlich von epi-DOX stammte, das häufig als Verunreinigung von DOX und seinem abiotischen Transformationsprodukt vorkommt. Im Chromatogramm der mit pm-rf-APGD behandelten DOX-Lösung wurden zwei zusätzliche Signale gefunden. Das Abbauprodukt (DP) 1 ergab die gleichen Massenspektren mit [M + H]+ 461,1541. Für diese Verbindung ordnete die Software die Formel C22H24N2O9 zu. Dies entspricht DOX plus einem O-Atom.

Der obere Teil – das Gesamtionenstromchromatogramm (TIC) von DOX (der unbehandelten Lösung); der untere Teil – der entsprechende TIC mit dem hinzugefügten Chromatogramm der mit pm-rf-APGD behandelten DOX-Lösung.

Die MS/MS-Spektren (dargestellt in Abb. S4, Zusatzinformationen) zeigten, dass sich die Fragmentierungsmuster des Hauptpeaks und des nächsten Peaks unterschieden. Die Hauptfragmentierung von DP1 erfolgte durch eine Freisetzung der OH-Gruppe (m/z 17). Das Abbauprodukt mit m/z von 417,1649 entsprach der Formel C21H24N2O7 und konnte DOX abzüglich der CO-Gruppe zugeordnet werden (Abb. S5, Ergänzende Informationen). Diese Masse ergab auch den zweiten chromatographischen Peak und das Fragmentierungsmuster durch MS/MS ergab auch [M-36 + H]+ (eine Freisetzung des H3NO-Fragments) und [M-17 + H]+. All dies deutet darauf hin, dass während der PM-RF-APGD-Behandlung von DOX Prozesse wie der Angriff des O-Radikals und die Entfernung des CO aus der chemischen Struktur von DOX unterschieden werden können. Bemerkenswerterweise gibt es in der chemischen Struktur von DOX mehrere anziehende Seiten. In der endgültigen wässrigen DOX-Probe war die Konzentration dieser Produkte gering, was darauf hindeutet, dass die Mineralisierung von DOX effizient war.

Nach HPLC-DAD- und UPLC-MS/MS-Analysen wurde die mit pm-rf-APGD behandelte Lösung den Messungen von TOC und TN (Änderungen im Gesamtgehalt an C- und N-haltigen Spezies/Produkten in der Lösung) unterzogen. und die Analyse mittels ATR FT-IR und UV/Vis (Änderungen in der chemischen Struktur der Zielverbindung, Gruppenidentifizierung neuer Arten/Produkte in der Lösung).

Zunächst wurden die TOC- und TN-Konzentrationen in den unbehandelten und mit pm-rf-APGD behandelten DOX-Lösungen bestimmt, um den Einfluss von pm-rf-APGD auf die Mineralisierung des Zielantibiotikums in der Lösung zu ermitteln. Es wurde festgestellt, dass nach der PM-rf-APGD-Behandlung der DOX-Lösung der TOC-Gehalt leicht anstieg (***p < 0,004) von 32,28 ± 0,04 µg mL−1 (die unbehandelte DOX-Lösung) auf 34,94 ± 0,42 µg mL− 1 (die mit pm-rf-APGD behandelte DOX-Lösung). Diese Veränderungen könnten mit der leichten Wasserverdunstung während der CAPP-Behandlung der DOX-Lösung zusammenhängen. Darüber hinaus könnten die beobachteten Abweichungen, wie von Sarangapani et al.16 berichtet, mit der Bildung von Carbonsäuren in der CAPP-behandelten Lösung zusammenhängen. Ihr Vorhandensein könnte die Wirksamkeit des DOX-Mineralisierungsprozesses beeinträchtigen, indem es ihn verlangsamt. Andererseits wurde unter Berücksichtigung der Änderungen der TN-Konzentration in den analysierten DOX-Lösungen festgestellt, dass der kontrollierte pm-rf-APGD-Betrieb zu einem Anstieg (****p < 0,0001) des TN-Gehalts um ungefähr führte 7,3-fach; 23,81 ± 0,32 µg mL-1 in der unbehandelten DOX-Lösung vs. 3,25 ± 0,03 µg mL-1 in der mit PM-rf-APGD behandelten DOX-Lösung. Dieser signifikante Anstieg wurde wahrscheinlich durch die Produktion von HNO3 oder HNO2 gemäß den folgenden Reaktionen verursacht: NO2 + OH = HNO3 und NO + OH = HNO230. Darüber hinaus wurden die NO2−-Ionen unter den sauren Bedingungen wahrscheinlich gemäß der folgenden Reaktion zu NO3−-Ionen oxidiert: 3HNO2 = NO3− + 2NO + H3O+, wie zuvor von Jamróz et al.30 im Hinblick auf eine DC-APGD berichtet wurde System. Die anderen Wege zur Herstellung von HNO3 und HNO2 umfassten verschiedene Formen von Stickoxid (NOx) mit Wasser und Wasserstoffperoxid: 2NO2 + H2O = NO2− + NO3− + 2H+, NO + NO2 + H2O = 2NO2− + 2H+ . Darüber hinaus werden die NO2−-Ionen leicht zu NO3– oxidiert (z. B. NO2− + H2O2 = NO3− + H2O, NO2− + O3 = NO3− + O2, 3HNO2 = NO3− + 2NO + H3O) oder zersetzt (2HNO2 = NO +). NO2 + H2O) und daher war die Konzentration dieser Ionen relativ niedrig31. Die durch Plasma ausgelöste Produktion von HNO3 und HNO2 wurde durch pH-Messungen der unbehandelten und der mit PM-rf-APGD behandelten DOX-Lösungen bestätigt. Der pH-Wert der mit pm-rf-APGD behandelten Lösung war ein Indikator für die RNS-Erzeugung. Der niedrigste pH-Wert hing mit der verstärkten Produktion der NO-Radikale (NO·) zusammen, die gleichzeitig in den Emissionsspektren des pm-rf-APGD-Systems beobachtet wurde. Die in der Lösung gebildeten NO-Radikale und ihre Derivate führten zur Bildung von HNO3 (daher wurde der pH-Wert gesenkt). Darüber hinaus wird die höchste Produktion von ROS beobachtet, insbesondere ·OH wurde bei dem niedrigsten pH-Wert von 17 beobachtet. Die verstärkte Produktion von ROS und RNS war für den effizienten Abbau der Zielverbindung verantwortlich. Die Richtigkeit dieser Annahme wurde durch HPLC-DAD-Analysen der mit pm-rf-APGD behandelten Lösung unter optimalen Betriebsbedingungen (auf den niedrigsten pH-Wert und die höchste T) verifiziert. In diesem Fall war die Effizienz des Abbaus der Zielverbindung nahezu quantitativ. Auf diese Weise wurde bewiesen, dass die Messung von pH- und T-Wert eine gute Möglichkeit zur Optimierung der Arbeitsparameter des pm-rf-APGD-Systems ist. Für die hier analysierte Lösung wurde ein Abfall des pH-Wertes von 4,11 auf 2,90 festgestellt, was die Ansäuerung der DOX-Lösung nach der pm-rf-APGD-Behandlung bestätigte.

Anschließend wurden ATR-FT-IR- und UV/Vis-Analysen von DOX-Lösungen durchgeführt, um Veränderungen in der chemischen Struktur des Zielantibiotikums nach der pm-rf-APGD-Behandlung zu definieren. Basierend auf den ATR-FT-IR-Studien wurden keine signifikanten Abweichungen in der Konformation der DOX-Funktionalitäten festgestellt. Unabhängig davon, wie hoch die DOX-Konzentration in der Lösung ist oder ob die Lösung vor oder nach der PM-RF-APGD-Behandlung analysiert wurde, ist das Vorhandensein der Banden im Zusammenhang mit C = C (~ 1644 cm−1) und O–H festzustellen (~ 3321 cm−1)-Bindungen sowie Streckschwingungen, die den O-H- und N-H-Bindungen (~ 2363 cm−1) zugeschrieben werden (Abbildung S6A)32 wurde bestätigt. Dies könnte mit den starken Streckschwingungen der O-H-Bindung zusammenhängen, die möglicherweise die Visualisierung von Änderungen im DOX erschwerten.

Bei der UV/Vis-Analyse wurde eine Abweichung in den Spektren der DOX-Lösung beobachtet, die nach der PM-RF-APGD-Behandlung erhalten wurde. Wie in Abbildung S6B zu sehen ist, löste die PM-RF-APGD-Behandlung der DOX-Lösung eine deutliche Abnahme des Absorptionswerts bei gleichzeitiger Rotverschiebung der Banden im Bereich von ~ 360 und ~ 280 nm aus. Die verringerte Absorption könnte mit einer verringerten DOX-Konzentration nach der pm-rf-APGD-Behandlung und einem verringerten pH-Wert der Lösung zusammenhängen. Allerdings könnten die oben genannten Veränderungen vermutlich auch mit Abweichungen in der chemischen Struktur von DOX zusammenhängen. Diese Annahme stimmt mit den Ergebnissen der UPLC-MS/MS überein (Abb. 3).

Um zu beurteilen, ob die pm-rf-APGD-Behandlung zu einer Verringerung der antibakteriellen Eigenschaften der DOX-Lösung führt, wurde der Standard-Scheibendiffusionstest mit drei Stämmen bakterieller opportunistischer menschlicher Krankheitserreger durchgeführt, nämlich E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 25904 und S. haemolyticus ATCC 29970, wurde durchgeführt.

Bei E. coli ATCC 25922, einem empfohlenen Referenzstamm für die Abschätzung der Antibiotika-Empfindlichkeit, wurde ein vollständiger Verlust der antibakteriellen Eigenschaften der mit pm-rf-APGD behandelten DOX-Lösung beobachtet (Abb. 4). Bezüglich zweier weiterer eingeschlossener Mikroorganismen, nämlich der klinischen Isolate S. haemolyticus ATCC 29970 und S. aureus ATCC 25904, wurden statistisch signifikante Unterschiede (Welch t-Test; p < 0,05; Abb. 4) in den gemessenen Hemmzonen für das Bakterienwachstum aufgezeichnet, wenn die PM -rf-APGD-behandelte DOX-Lösung wurde im Gegensatz zur unbehandelten DOX-Kontrolllösung aufgetragen. Die Abnahmen zwischen den Mittelwerten der Wachstumshemmungsdurchmesser betrugen 37 % bzw. 29 %, bezogen auf die an S. haemolyticus ATCC 29970 bzw. S. aureus ATCC 25904 durchgeführten Tests (Abb. 4).

Antibakterielle Eigenschaften der mit pm-rf-APGD behandelten DOX-Lösung im Vergleich zur nicht mit Plasma behandelten Kontrolllösung. Es wurde ein Standard-Scheibendiffusionsassay durchgeführt. Dargestellt sind Mittelwerte ± Standardfehler der gemessenen Durchmesser der Bakterienwachstumshemmung. Sternchen markieren statistisch signifikante Unterschiede (Welch Two Sample t-Test bei p < 0,05) zwischen den antimikrobiellen Wirkungen der CAPP-behandelten DOX-Lösungen im Gegensatz zu den entsprechenden Kontrollen. Das Experiment wurde dreimal mit jeweils drei technischen Wiederholungen durchgeführt. Die folgenden Bakterienstämme wurden verwendet: E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 25904 und S. haemolyticus ATCC 29970. DOX – Doxycyclin. pm-rf-APGD – pulsmodulierte Hochfrequenz-Atmosphärendruck-Glimmentladung.

Leider wurde in den früheren Studien, in denen verschiedene CAPP-Quellen für den Abbau von DOX20,21 verwendet wurden, die unserer Meinung nach entscheidende Frage hinsichtlich des Verlusts oder der Beibehaltung der antimikrobiellen Eigenschaften der mit CAPP behandelten DOX-Lösungen nicht angesprochen. Zuvor berichteten Zhang et al.33 über den Verlust der antimikrobiellen Eigenschaften einer Cefiximlösung gegenüber E. coli ATCC 25922 nach der CAPP-Behandlung in Blasen vergrößerter Gas-Flüssigkeits-Grenzflächen. Dieses Ergebnis stimmte mit unserer Beobachtung überein, dass die mit pm-rf-APGD behandelte DOX-Lösung keine antibakterielle Wirkung gegen denselben Bakterienstamm aufweist. Ähnlich zu den hier beschriebenen Daten beobachteten Sarangapani et al.16 auch eine Abnahme der antimikrobiellen Wirkung gegenüber E. coli- oder B. subtilis-Stämmen von Ciprofloxacin und Ofloxacin, suspendiert entweder in Wasser oder Fleischabwässern, nach 15–25 Minuten einer CAPP-Exposition . Daher fanden wir Hinweise darauf, dass die plasmabasierte Technologie eine Lösung für das häufig gemeldete Problem der Unwirksamkeit der Antibiotikaentfernung durch herkömmliche Abwassermanagementpraktiken sein könnte34.

Darüber hinaus deuten die Studien von Li et al.35 und Liao et al.36 auf weitere Vorteile von CAPP-basierten Ansätzen zur Dekontamination flüssiger Abfälle aus Antibiotika hin. Es scheint, dass die Anwendung der CAPP-basierten Technologie neben dem direkten Abbau der Moleküle mit biozider Wirkung auch zur Eliminierung multiresistenter Bakterienstämme und zum Abbau von DNA führen kann, die Gene enthält, die den Erwerb einer Antibiotikaresistenz ermöglichen (z. B. tet(C), tet(W). ), blaTEM-1, aac(3)-II) und Integron-Gen intI1) und Verringerung der Häufigkeit eines horizontalen Gentransfers durch Konjugation35,36. Solche komplexen Ergebnisse der CAPP-basierten Behandlung wären für die Dekontamination von Abwässern aus Krankenhäusern und Kliniken von großem Nutzen. Beispielsweise überwachten Nguyen et al.37 die Abbaueffizienz von Ofloxacin, Ciprofloxacin, Cefuroxim und Amoxicillin in der CAPP-basierten Abwasseraufbereitungsanlage in einem der vietnamesischen Krankenhäuser. Die erzielten Abbauraten des Arzneimittels waren hoch, nämlich über 99 % für Cefuroxim und Ciprofloxacin und 72 % für Amoxicillin und Ofloxacin. Bedauerlicherweise untersuchten die Autoren jedoch nicht die Schwankungen in der Menge der nachgewiesenen Kolibakterien vor und nach der CAPP-Behandlung. Es wäre interessant, diesen Aspekt in Zukunft zu berücksichtigen, insbesondere angesichts der hohen mikrobiologischen Kontaminationsraten von Abwässern aus Krankenhäusern (1,5 × 105 − 1,4 × 107 KBE/100 ml; Nguyen et al.37). Ein möglicher Nachteil eines CAPP-Ansatzes wurde von Gilmore et al.38 aufgeführt, der über die Induktion eines vorübergehenden, ruhenden, metabolisch inaktiven Phänotyps berichtete, der in der CAPP-exponierten Mikrobenpopulation zu einer erhöhten Stresstoleranz führt und zur Bildung persistierender oder lebensfähiger Bakterien führt aber nicht kultivierbare (VBNC) Zellen. Daher wird eine Forschungsrichtung, die darauf abzielt, direkte antimikrobielle und arzneimittelabbauende Eigenschaften von CAPPs zu kombinieren, nachdrücklich unterstützt, obwohl die zur Bestätigung ihrer Wirksamkeit geplanten Experimente nicht ausschließlich auf mikrobiologischen Standardkultivierungsansätzen basieren sollten, die einen bemerkenswerten Pool an Antibiotikaresistenzen in der Umwelt außer Acht lassen Gene, nämlich die VBNC-Zellen.

Um die PM-RF-APGD-Flüssigkeitswechselwirkungen aufzudecken, die am DOX-Abbauprozess beteiligt sind, wurden die Gesamtkonzentration von ROS und die Konzentration ausgewählter RONS, einschließlich NO3−, NO2− und H2O2, in der DOX-haltigen Flüssigkeit bestimmt Lösung.

Es wurde festgestellt, dass die Konzentration der gemessenen RONS nach Durchführung der pm-rf-APGD-Behandlung der DOX-Lösung stark anstieg. Betrachtet man die gesamte ROS-Konzentration in der mit pm-rf-APGD behandelten DOX-Lösung, erreichte sie 20,88 ± 1,30 µg L−1, während für die unbehandelte DOX-Lösung keine ROS bestimmt wurden (Abb. 5). Da H2O2 eine Schlüsselrolle beim DOX-Abbau nach der PM-RF-APGD-Behandlung spielt, wurde die H2O2-Konzentration auch mit anderen kolorimetrischen Tests gemessen. Es wurde festgestellt, dass die H2O2-Konzentration in der DOX-Lösung nach der Behandlung mit pm-rf-APGD 4,34 ± 0,60 mg L−1 betrug. Für die unbehandelte DOX-Lösung wurde kein H2O2 nachgewiesen. Die ermittelte H2O2-Konzentration geht in die geschätzte Gesamtmenge an ROS ein. Der Beitrag von H2O2 zur bewerteten gesamten ROS-Konzentration bleibt jedoch gering, was auf die signifikante Beteiligung der übrigen ROS, insbesondere ·OH und O3, am DOX-Abbau hinweist.

Die Konzentration reaktiver Stickstoff- (a) und Sauerstoffspezies (b), bestimmt in der mit pm-rf-APGD behandelten DOX-Lösung zusätzlich zur unbehandelten DOX-Lösung. Angegeben sind Mittelwerte ± Standardfehler der gemessenen Konzentrationen der reaktiven Formen. Sternchen markieren: statistisch signifikante Unterschiede (einseitige Varianzanalyse mit dem Tukey-Post-hoc-Test; ****p < 0,0001).

Der nächste Schritt in weiteren Studien zu den PM-RF-APGD-Flüssigkeitswechselwirkungen, die am DOX-Abbauprozess beteiligt sind, bestand darin, den Einfluss einer verringerten Erzeugung der wichtigsten ROS auf die Abbaueffizienz von DOX zu bestimmen. Durch die Eliminierung von ·OH und getrennt von H2O2 mit O3 aus den Zersetzungsprozessen von DOX war es möglich, die einzelnen Rollen dieser Spezies in den ablaufenden Prozessen abzuschätzen. Es wurde festgestellt, dass die nukleophile Wirkung von ·OH zu einer Abbaueffizienz von 33,8 % führte, verglichen mit einer Abbaueffizienz von 83,5 % von DOX in der Lösung ohne Ethanol. Darüber hinaus führte das H2O2-Abfangen in der mit pm-rf-APGD behandelten DOX-Lösung zu einem DOX-Abbau von 21,8 %, verglichen mit der oben erwähnten Abbaueffizienz von DOX von 83,5 % in der Lösung ohne fötales Rinderserum (FBS). In Anbetracht der erhaltenen Unterschiede nach dem Abfangen der spezifischen reaktiven Individuen schien es, dass die Zersetzung von DOX wahrscheinlich auf die Anwesenheit von H2O2 und O3 zurückzuführen war. Unter diesem Gesichtspunkt könnte der wahrscheinliche Mechanismus durch die Wirkung des ·OH-Radikals auf die Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung erfolgen. Die Anlagerung der nachfolgenden Spezies führte zur Bildung weiterer Zwischenprodukte, die wiederum zu einer Decarboxylierung oder Substitution von Aminogruppen führten. All diese Phänomene können zur Öffnung des aromatischen Rings führen. Für einen vollständigen Überblick über die möglichen Zwischenprodukte, die unter diesen Bedingungen entstehen, und weitere Reaktionen, an denen sie beteiligt sind, kann auf den Artikel von Magureanu et al.17 verwiesen werden. Die deutlichsten Erhöhungen des RNS-Gehalts wurden hingegen bei den NO3−-Ionen beobachtet, nämlich von 0,59 ± 0,52 mg L−1, bestimmt in der unbehandelten DOX-Lösung, auf 41,93 ± 2,85 mg L−1 gemessen in der mit pm-rf-APGD behandelten DOX-Lösung (Abb. 5). Ein ähnliches Muster wurde im Fall der NO2−-Ionen beobachtet, deren Konzentration nach der PM-RF-APGD-Behandlung der DOX-Lösung anstieg, dh von 2,0 ± 1,7 mg L−1, quantifiziert in der unbehandelten DOX-Lösung, auf 64,0 ± 1,8 mg L−1 bestimmt in der mit pm-rf-APGD behandelten DOX-Lösung (Abb. 5). Die deutlich erhöhten Konzentrationen der NO2- und NO3-Ionen bestätigten die Bildung dieser RNS mit längerer Lebensdauer nach den PM-RF-APGD-Flüssigkeitswechselwirkungen. Darüber hinaus resultierte die zusätzliche Quelle des erwähnten RNS aus der Zersetzung der DOX-Lösung, die mit Hilfe des pm-rf-APGD-Systems behandelt wurde, was die Wirksamkeit dieses Prozesses bestätigt. Darüber hinaus führt das Vorhandensein der NO2−- und NO3−-Ionen in der flüssigen Umgebung zur Produktion von HNO2 und HNO3, wodurch der pH-Wert der Umgebung ausreichend gesenkt wird. Der niedrige Säuregehalt hat einen erheblichen Einfluss auf die weiteren Kaskadenreaktionen und beschleunigt die Bildung von ·OH, das eine entscheidende Rolle beim Abbau von DOX spielt.

Es gibt ein breites Spektrum an Faktoren, die Einfluss auf die Eigenschaften der CAPP-Behandlung haben. Somit beeinflussen die Strom-Spannungs-Eigenschaften der Entladung, die Elektrodenkonfiguration und die Methode der Lösungseinführung sowie ihr Kontakt mit der Entladung erheblich den Beitrag der wichtigsten RNS und ROS zum Prozess der Arzneimittelzersetzung. Aus dieser Perspektive führte der Einsatz von Reaktions-Entladungssystemen auf DC-APGD-Basis39, bei denen die NH4NO3-Lösung als fließende flüssige Kathode fungierte, zur Produktion einer deutlich geringeren Menge der NO2−-Ionen, nämlich 9,3 µg mL−1 als im hier verwendeten PM-RF-APGD-System. Dort betrug die Konzentration an NO3-Ionen in der unbehandelten gegenüber der mit dem CAPP-basierten Reaktions-Entladungssystem behandelten NH4NO3-Lösung 1624 bzw. 1195 µg mL−1. Andererseits wurde die Gesamt-ROS-Konzentration mit 28,79 µg mL−1 bestimmt, was gut mit den in der vorliegenden Arbeit präsentierten Ergebnissen übereinstimmt (20,88 ± 1,30 µg mL−1). Betrachtet man jedoch die frühere Analyse der RONS-Konzentration, die in komplexeren Flüssigkeiten wie Kulturmedien durchgeführt wurde, die in einem stationären Regime von anderen CAPP-Quellen behandelt wurden, waren die ermittelten Konzentrationen der untersuchten RNS und ROS vergleichbar. Genauer gesagt führte eine dielektrische Barrierenentladung (DBD), die in Kontakt mit 1,50 ml eines DMEM-Kulturmediums erzeugt wurde, zur Produktion von 10,00 ± 0,01 µg mL−1 der NO2−-Ionen, 1,20 ± 0,08 µg mL−1 der NO3−-Ionen und 19,5 ± 0,4 µg mL−1 der NH4+-Ionen sowie 3,31 ± 0,03 µg mL−1 H2O2-Moleküle40. Trotz der deutlich niedrigeren Konzentrationen von NO2– und NO3–-Ionen, die im mit CAPP behandelten Kulturmedium aufgezeichnet wurden, entsprachen die Konzentrationen der NH4+-Ionen und von H2O2 gut den in dieser Arbeit für diese Arten gemessenen Werten. Die Konzentrationen von RONS wurden zuvor auch in anderen plasmabehandelten Puffern gemessen. Beispielsweise führte eine 20-sekündige CAPP-Behandlung von 1,0 ml PBS zur Produktion von 1,7 µg mL−1 H2O240. In einer anderen Studie führte die Aktivierung von 2,0 ml PBS für 5 Minuten zur Produktion von 17,72 µg mL−1 NO2−-Ionen bzw. 1,28 µg mL−1 NO3−-Ionen42. Daher führten die hier beschriebenen Plasma-Flüssigkeits-Wechselwirkungen zur Produktion von NO2−- und NO3−-Ionen sowie H2O2-Molekülen, deren Konzentrationen in guter Übereinstimmung mit den in anderen Studien berichteten Konzentrationen zu sein schienen.

Wie oben beschrieben, resultierte die Zersetzung von DOX aus der wässrigen Lösung mit dem pm-rf-APGD-System wahrscheinlich aus der Bildung von RNS und ROS wie NO3−, NO2−, NH, N2, N2+, ·OH und H2O2, wie bestimmt durch OES in der Gasphase des CAPP-Systems und die verwendeten kolorimetrischen Methoden in der behandelten Lösung. Wie in früheren Studien vermutet, zeigten diese reaktiven Personen eine hohe Wirksamkeit bei der Beseitigung chemischer und biologischer Verunreinigungen aus flüssigen Abfällen43. Hier haben wir gezeigt, dass neben dem 79 ± 4,5 %igen Abbau von DOX durch RONS, die im verwendeten pm-rf-APGD-System erzeugt wurden, die CAPP-behandelte DOX-Lösung je nach untersuchter Bakterienart entweder ihre biozide Aktivität vollständig verlor oder deutlich abnahm .

Aus dieser Sicht erwarten wir eine Verringerung des Selektionsdrucks, der durch die mit pm-rf-APGD behandelten Lösungen entsteht, und können daher auch von geringeren Raten des horizontalen Gentransfers und einer Einschränkung der Selektion frei lebender Mikrobenpopulationen ausgehen Gene, die die Antibiotikaresistenz bestimmen7,8. Dies führt dazu, dass diese genetischen Determinanten humanpathogene Bakterien mit hoher klinischer Bedeutung nicht so effektiv erreichen. Daher werden Antibiotika, in unserem Fall auch DOX, weiterhin eine verfügbare Therapieoption bleiben. Unsere Forschung hat gezeigt, dass Plasma auf PM-RF-APGD-Basis eine effiziente, innovative und kostengünstige Alternative für die Behandlung von Abwasserverunreinigungen sein könnte, auch von solchen, die schwer zu bewältigen sind44. Allerdings muss im Hinblick auf mögliche zukünftige Anwendungen des hier beschriebenen PM-rf-APGD-basierten Reaktions-Entladungssystems für Abwasserreinigungszwecke sichergestellt werden, dass die mit CAPP behandelten Flüssigkeiten und die erzeugten Abfälle keine Umweltrisiken darstellen stören nachhaltige ökologische Prozesse in der Biosphäre45. Einer der zu berücksichtigenden Aspekte wäre, wie lange die erzeugten RONS ihr Red-Ox-Potenzial zeigen. Auch eher niedrige pH-Werte der mit PM-RF-APGD behandelten Lösung sollten neutralisiert werden, z. B. während Denitrifikationsprozessen in herkömmlichen Abwasseranlagen44 oder durch die Verwendung von Kalk oder Zementofenstaub46. Darüber hinaus müssen wir bei einer zukünftigen Skalierung und Anpassung dieser Technologie an industrielle Anforderungen berücksichtigen, dass ein Bruchteil der durch PM-RF-APGD erzeugten RONS von der Abwassermatrix verbraucht wird36, wodurch geringere Konzentrationen zurückbleiben Diese Personen sind für den Schadstoffabbauprozess zugänglich. Die oben aufgeführten Probleme werden in unserer zukünftigen Forschung weiter untersucht.

Wir haben zum ersten Mal gezeigt, dass das entwickelte und optimierte PM-RF-APGD-Durchfluss-Reaktions-Entladungssystem effizient für die Zersetzung von DOX aus wässrigen Lösungen eingesetzt werden kann und daher die antimikrobiellen Eigenschaften dieses Arzneimittels einschränkt. Um die optimalen Betriebsparameter des entwickelten Reaktions-Entladungssystems zu finden, unter denen die DOX-Lösung erfolgreich abgebaut wird, wurde eine multivariate Optimierung durchgeführt, die die Auswirkungen der CAPP-Betriebsparameter auf pH-Wert und Temperatur der CAPP-DOX-Lösung aufdeckte. Basierend auf der statistischen Analyse wurde festgestellt, dass die Durchflussrate der DOX-Lösung, das Tastverhältnis für den pulsmodulierten Hochfrequenz-Wechselstrom und die DOX-Konzentration in der Lösung entscheidende Rollen beim Erreichen der beabsichtigten Betriebsbedingungen, also Parameter, spielen Unter diesem Wert ist T der CAPP-behandelten Lösung am höchsten, während der pH-Wert am niedrigsten ist. Indem die DOX-Lösung einem PM-RF-APGD-Lauf unter den festgelegten optimalen Betriebsparametern unterzogen wurde, wurde eine Zersetzungsrate von DOX von 79 ± 4,5 % festgestellt. Die Abbauprodukte von DOX waren DOX plus ein O-Atom und DOX minus CO. Die Veränderungen in den DOX-UV/Vis-Spektren wurden nach der CAPP-Behandlung festgestellt, was den Abbau dieses Antibiotikums zu Produkten mit niedrigerem Molekulargewicht weiter bestätigte. Die mit pm-rf-APGD behandelte DOX-Lösung zeigte keine antimikrobiellen Eigenschaften gegenüber dem Modellstamm für Antibiotika-Empfindlichkeitstests, d. h. E. coli ATCC 25922, und verringerte ihre bioziden Aktivitäten gegenüber den klinischen Isolaten S. haemolyticus ATCC deutlich um 37 % bzw. 29 % 29970 bzw. S. aureus ATCC 25904. Durch die Aufdeckung der Wechselwirkungen zwischen CAPP und Flüssigkeit wurde festgestellt, dass ROS und RNS, in unserem Fall NO3−, NO2−, NH, N2, N2+, OH und H2O2, an der DOX-Zersetzung beteiligt sind. Wir gehen davon aus, dass die zukünftige Implementierung der hier entwickelten effizienten, innovativen und kostengünstigen DOX-Abbaumethode in Abwasseraufbereitungsanlagen Vorteile für das öffentliche Gesundheitswesen bringen wird, indem die Häufigkeit des Auftretens multiresistenter Stämme verringert wird. Daher könnte die Behandlung bakterieller Infektionen im Krankenhausbereich immer noch mit den häufig verwendeten Antibiotika bewältigt werden.

Acetonitril

Varianzanalyse

Abgeschwächtes Totalreflexionsvermögen Furrier Transform-Infrarot

Kaltes Atmosphärendruckplasma

Versuchsplanung

Doxycyclin

Abbauprodukt

Fließende Flüssigkeitselektrode

Vollständiges vertikales Bieten

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie – Diodenarray-Detektion

Flüssigchromatographie-Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometrie

Nachweisgrenze

Bestimmungsgrenze

Mueller–Hinton Agar

Mueller-Hinton-Brühe

Nicht ausspülbarer organischer Kohlenstoff

Optische Emissionsspektrometrie

Pulsmodulierte Hochfrequenz-Atmosphärendruck-Glimmentladung

Reaktive Stickstoffspezies

Reaktive Sauerstoffspezies

Reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies

Relative Standardabweichung

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Diese Studien wurden im Rahmen des SONATA 15-Projekts durchgeführt, das Dr. Anna Dzimitrowicz (UMO-2019/35/D/ST8/04107) vom National Science Center (NCN), Polen, gewährt wurde.

Abteilung für Analytische Chemie und Chemische Metallurgie, Breslauer Universität für Wissenschaft und Technologie, 27 Wybrzeze St. Wyspianskiego, 50-370, Breslau, Polen

Anna Dzimitrowicz, Dominik Terefinko, Pawel Pohl und Piotr Jamroz

Abteilung für Umweltanalyse, Fakultät für Chemie, Universität Danzig, 63 Wita Stwosza, 80-308, Danzig, Polen

Magda Caban & Piotr Stepnowski

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Weronika Babinska, Ewa Lojkowska, Wojciech Sledz & Agata Motyka-Pomagruk

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Piotr Cyganowski

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AD, DT und AMP konzipierten die Arbeit. AD, DT und PJ passten das CAPP-basierte Reaktions-Entladungssystem an und führten eine multivariate Optimierung dieses Systems durch, um die optimalen Betriebsbedingungen für die DOX-Zersetzung zu finden. MC führte HPLC-DAD- und UPLC-MS/MS-Studien durch und analysierte die erhaltenen Ergebnisse. PP führte die statistischen Analysen durch und beschrieb sie. AD führte die TOC/TN-Analysen durch. DT und PJ erfassten und analysierten OES-Messungen. PC zeichnete und analysierte ATR-FT-IR- und UV/Vis-Spektren. WB, WS und AMP führten mikrobiologische Tests durch. WS und AMP interpretierten die gesammelten mikrobiologischen Ergebnisse. AD, DT und PJ zeigten die Wechselwirkungen zwischen CAPP und Flüssigkeit, die zum DOX-Abbau führten. DT untersuchte die Auswirkungen von Scavengern auf die gesamte RONS-Produktion. AD hat Fördermittel für diese Forschung eingeworben. EL und PS beteiligten sich an der Diskussion. Der PC bot eine grafische Unterstützung. AD und AM-P haben mit Hilfe von MC, DT, PJ und PP das vorgestellte Manuskript verfasst. AD korrigierte die Manuskripte entsprechend den Kommentaren der Co-Autoren. AD, DT, PP und PJ bereiteten die Antworten auf die Kommentare und Vorschläge der Gutachter vor. Alle Autoren stimmten der vorgelegten Version des Manuskripts zu.

Korrespondenz mit Anna Dzimitrowicz.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Dzimitrowicz, A., Caban, M., Terefinko, D. et al. Anwendung einer pulsmodulierten Hochfrequenz-Atmosphärendruck-Glimmentladung zum Abbau von Doxycyclin aus einer fließenden flüssigen Lösung. Sci Rep 12, 7354 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-11088-w

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Eingegangen: 04. Oktober 2021

Angenommen: 11. April 2022

Veröffentlicht: 05. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11088-w

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